浮游微生物在水生生物地球化学过程中起着关键作用，受多种因素的影响。本研究采用高通量测序技术对青海高原黑河流域上游水体浮游细菌群落进行了调查研究。根据结果得出，丰度的支流微生物组合则在免疫系统方面具备极其重大功能。本研究首次探讨了黑河流域浮游细菌群落组成与环境因子的关系，为黑河流域水环境的健康有序发展提供了理论依据。

  和As外，别的环境因子均保持一致，8个采样点的各项指标均无显著差异（Mann-WhitneyU检验，p ＞ 0.05）。地表水温度为7.2℃~ 19.7℃，pH为8.27-8.45，属弱碱性。在干流采样点中，H3和H4的溶解氧（DO）水平较低（＜ 5.7 mg/L），而H3和H6的As水平较高（0.80 mg/ml）。主流采样点COD

  浓度为1.6-4.08 mg/L。除总氮（TN）（均超过1.5 mg/L，地表水V类标准），汞（Hg）（均超过0.0001 mg/L，地表水IV类标准）以及高锰酸钾指数（COD

  ）（均超过4 mg/L，地表水III类标准）外，其他指标均符合国家地表水环境品质衡量准则II类水标准（GB38382 2002）。支流TN、TP和Cr

  水平普遍高于干流。综合理化指标根据结果得出，黑河上游干流水质优于支流水质。

  Illumina Miseq测序获得556 188条序列。每个样品的覆盖率均超过99%，说明样品中存在的大多数微生物种类都被鉴定出来了。稀疏曲线趋于饱和，表明测序深度足以支持后续的分析。表2列出的微生物多样性指数包括群落丰富度指数（Ace， Chao）和群落多样性指数（Shannon， Simpson）。两种测量方法在主流和支流之间均未观察到显著差异（Mann-Whitney U检验，p 0.5）。从图1能够准确的看出，各采样点的群落多样性指数是动态分布的。H2的群落丰富度和多样性最大，Chao指数为2014.803，Shannon指数为5.529。根据结果得出，黑河支流浮游细菌的总体丰度高于干流。

  系统发育分类结果为，所有样品有36个门，包括91纲、263目、441科和883属。图1显示了不同样本在门水平上的浮游细菌群落组成。在门水平上，在每个样本中鉴定出36个不同的细菌门。在所有采样点中，浮游细菌群落以变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）为主，这两个门的相对丰度分别为62.46%和20.07%。另外两个占有较大丰度的门为拟杆菌门（Bacteroidetes）（4.42%）和放线菌门（Actinobacteria）（4.40%）。变形菌门的平均相对丰度在主河道高于支流，而左图分析显示，主河道厚壁菌门的相对平均丰度（0.29%）明显低于支流（29%）（图2）。不同采样点类的分布情况见表S1。根据结果得出，最常见的类群为γ变形菌纲（43.84%）、杆菌纲（18.12%）和α变形菌纲（17.38%）。γ变形菌纲是黑河上游水体最大的优势类群，其相对丰度最高，为8.12%-62.26%。

  在属水平上，利用热图分析了不同采样点浮游细菌群落结构，除H2外，其余采样点均聚集在一起。如图2所示，H3、H5、H6、H8菌株的优势菌种为硫单胞菌和酸化杆菌。H5中硫单胞菌的相对丰度高达80.61%，H6中硫单胞菌的相对丰度为32.55%。H6中酸化杆菌的相对丰度为51.92%，H8中酸化杆菌的相对丰度为33.96%。H3中酸杆菌门的相对丰度为71.97%。H1采样点优势种为Rhodanobacter，其相对丰度为29.56%。

  图2.聚类热图显示了在属水平上不同类群的主要细菌种类。每个矩形的颜色取决于类群百分比的log10值，如图左边的图例所示。顶部树显示了样本的聚类关系。

  RDA）确定与浮游细菌群落结构变化相关的环境变量（图3）。前两个轴解释了细菌群落结构中RDA 1的73.47%和RDA 2的18.07%，表明所选择的外因驱动浮游细菌群落结构的差异。在所有的外因中，TN （R2 = 0.724， p = 0.046）显然对浮游细菌群落的影响最显著，COD

  （R2 = 0.547， p = 0.136）、TP （R2 = 0.494， p = 0.192）和pH （R2 = 0.406， p = 0.267）均能解释大部分差异。变形菌门与TN、TP、COD

  -N呈正相关，与海拔负相关。厚壁菌门与所选环境因子呈负相关。总的来说，TN、COD

  、TP和pH对浮游细菌群落多样性影响较大，是影响黑河上游浮游细菌群落变化的主要因素。

  图4.LDA分析表明，干流（M）和支流（T）的分布存在非常明显差异，LDA得分越大，物种丰度对差异效应的影响越大。

  利用PICRUSt进行群落预测分析，确定所观察到的浮游细菌的功能。在大多数样本中，功能的相对丰度通常是相似的（图S3）。基于KEGG数据库，获得六大类生物代谢途径:代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病和生物系统。代谢、遗传信息处理和环境信息处理是主要成分，分别占49.18%、16.73%和13.37%。对预测基因二级功能水平的分析确定了41个子功能（图5）。微生物的功能最重要的包含膜运输（10.87%）、氨基酸代谢（10.35%）、碳水化合物代谢（9.61%）、复制与修复（7.41%）、能量代谢（6.18%）和转化（4.52%）。干流微生物组合中较高的KOs丰度属于萜类和多酮类代谢，而支流中较高的KOs丰度属于免疫系统（图S4）。但在碳水化合物代谢、能量代谢和氨基酸代谢3种核心资源代谢途径的相对丰度上，干流微生物和支流微生物没有显著差异。

  本研究首次对黑河上游浮游细菌群落进行了高通量测序，并报道了细菌群落对环境因子的响应。

  高通量测序多个方面数据显示，黑河上游干流和八宝河支流中存在7种优势浮游细菌类群:变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinomyceteria）、Deinococcus‐Thermus和蓝藻门（Cyanobacteria）。这一结果与国内外对江河湖泊浮游细菌群落的研究结果相似，符合江河湖泊等淡水水体典型细菌群落组成规律。变形菌群具有很强的适应性，能利用水体中的氮、磷污染物，广泛分布于河流、湖泊和海洋中。研究表明，γ变形菌纲的高丰度比与整体富营养化有着重要的关系。本研究中变形菌门占非常大的优势，各采样点的平均相对丰度高达62.46%。在H1、H3和H5采样点，变形菌门的丰度均在80%以上。LDA结果进一步证实了影响黑河上游差异的主要细菌门几乎都是变形菌门。变形菌门的优势类群为γ变形菌纲，平均相对丰度为43.84%，在H1采样点和H5采样点中分别高达62.26%和84.5%。γ变形菌纲被认为是反硝化菌群之一，因此可能是决定河流清除多余氮的重要类群，这一纲的许多物种都适应寒冷。刘等研究了渭河汛期浮游细菌群落结构特征，发现变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroides）是主要的微生物类群，相对丰度分别为46%和27%。β变形菌门（Betaproteobacteria）是最重要的类群，但与本研究结果不同。这可能是由于黑河特殊的地理环境、低温和高海拔以及青藏高原显著的氮沉降和降水增加，导致了适应寒冷的伽马变形菌的大量增加。刘等和Jones等人都发现厚壁菌门是灰尘中的主要细菌群。在我们的研究中，厚壁菌门（Firmicutes）是黑河上游干流的第二优势菌群，这与其他研究中认为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）是河流的优势菌群不一致。这可能是黑河地处祁连山，坡度高、坡度陡，土壤疏松，植被稀疏，表层土壤造成的。在降雨条件下，大量泥沙被地表径流带入河流，导致黑河上游干流中厚壁菌门含量较高。研究还发现，表层淡水水体中厚壁菌门的相对丰度一般小于1%。厚壁菌门相对丰度较高的水体有几率存在动物粪便污染。拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度排名第三，是一种常见的致病菌，常见于人类和动物。它在复杂生物聚合物的降解中发挥着及其重要的作用，并参与碳的富集和蛋白质的循环。也有学者发现拟杆菌门与水体富营养化紧密关联。本研究在每个采样点都检测到了拟杆菌门，表明黑河上游水体处于富营养化状态。

  。除嗜酸杆菌属于厚壁菌门杆菌纲外，其余均属于γ变形菌纲。硫单胞菌是嗜酸的，但也可以在接近中性的pH值下生长，它们能在酸性矿井中自由生长。硫单胞菌是一种混合营养生物，可通过环境中的硫化物获取能量，同化有机物，氧化亚砷酸盐，有助于砷的沉淀和自然生物修复。在本研究中，除H2外，硫单胞菌在所有采样点均存在，H5和H6的相对丰度分别高达80.61%和32.55%。但各点砷含量约为0.0006 mg/L，远低于《饮用水砷状态》规定的最高允许浓度0.01 mg/L。这一发现与硫单胞菌在砷污染水体甚至酸性矿山废水中广泛存在的研究结果相反。砷主要以砷化合物的形式沉积在河底，这可能与黑河上游海拔高、气温低有关。本研究的水样为地表水，检测到的砷浓度较低。酸化杆菌、酸胞菌属和硫杆菌属常出现在矿物浸出环境或酸性水环境中。黑河pH值为8.27-8.45，属弱碱性，砷等金属离子含量较低，不是富集这些微生物的最适宜条件。该地区除了具有独特的水文、生物、气候和地貌外，还具有非常明显的地质和成矿条件。布等研究了黑河上游表层土壤中的重金属，他发现，Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、As、Cd和Pb的平均值均高于青海省、西藏、中国和世界的平均值。综上所述，受大风和降雨影响，黑河上游前6属的硫单胞菌、酸化杆菌、酸胞菌属和硫杆菌属主要来自于沿河沉积物。

  许多研究表明，水体细菌群落的丰度和多样性可能受到水温、pH、DO、TN和TP等多种外因的影响。黑河上游干流及支流水体理化指标在不同采样点存在一定的差异，不同河段所承载的环境压力及周围人类活动对水环境的影响具有较高的空间异质性。在本研究中，RDA显示温度、pH、海拔、TN、TP、COD

  ‐N可以很好地解释黑河上游浮游细菌群落组成的差异。TN是影响浮游生物群落结构的重要的因素。黑河上游水体TN含量明显超标，由于人类活动和农业生产的影响，过量的氮导致水体富营养化和水质恶化。无机氮是异养细菌重要的氮源，高浓度的无机氮使异养细菌在水中大量繁殖。COD

  是衡量水污染程度的综合指标，以高锰酸钾为氧化剂，将水中的有机物转化为氧气。COD

  越高，水体污染程度越大。pH是浮游细菌组成的另一个主要的因素，主要影响浮游植物群落的结构和多样性。TN、TP、COD

  和pH抑制了厚壁菌门的生长，但不同程度地增加了变形菌门和放线菌门的丰度，说明变形菌门和放线菌门对河流中碳、氮等有机污染物的变化拥有非常良好的适应性。

  PICRUST的预测根据结果得出，每个采样点的浮游细菌都参与代谢、遗传信息处理和环境信息处理六大代谢途径。它们有40个子功能，并表现出较高的功能丰度。在本研究中，膜运输是每个采样点在KEGG水平2上最丰富的途径，这与报道的细胞膜运输在细菌中广泛存在，是最重要的生物过程之一的结果一致。

  综上所述，本研究首次采用基于16S rRNA基因的高通量测序技术对黑河上游浮游细菌群落结构可以进行分析。结果表明，除H5采样点中TN、汞、COD

  超标，其余各采样点水质均符合二类水质标准。该地区浮游细菌群落的多样性相比来说较高。在门水平上主要的浮游细菌群是变形菌门，厚壁菌门，拟杆菌门和放线菌门。主要的细菌属有硫单胞菌属，

  。八宝河的水位以及浮游生物细菌的丰度和多样性明显高于黑河干流的水位。RDA分析表明TN、TP、COD

  和pH是浮游生物细菌空间分布的主要限制因子。PICRUSt推测，具有较高KOs丰度的主流微生物组合属于萜类和多酮类代谢，而具有较高KOs丰度的支流微生物属于免疫系统。综上所述，本研究揭示了黑河浮游细菌群落组成及其与环境因子的关系，为了解青海高原黑河的微生物生态和环境保护提供一定的理论依照。